haku: @instructor Kotiaho, Tapio / yhteensä: 5
viite: 1 / 5
« edellinen | seuraava »
| Tekijä: | Sikanen, Tiina Marjukka |
| Työn nimi: | Development of microfluidic analytical devices for protein characterization by electrospray ionization mass spectrometry |
| Mikrofluidististen analyysilaitteistojen kehittäminen proteiinien karakterisointiin sähkösumutusionisaatio-massaspektrometrialla | |
| Julkaisutyyppi: | Diplomityö |
| Julkaisuvuosi: | 2010 |
| Sivut: | 86 + [14] Kieli: eng |
| Koulu/Laitos/Osasto: | Kemian ja materiaalitieteiden tiedekunta |
| Oppiaine: | Epäorgaaninen kemia (Kem-35) |
| Valvoja: | Kulmala, Sakari |
| Ohjaaja: | Kostiainen, Risto ; Kotiaho, Tapio |
| Sijainti: | KE | Arkisto |
| Avainsanat: | microfluidics proteomics electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry mikrofluidistiikka proteomiikka elektroforeesi sähkösumutusionisaatio massaspektrometria |
| Tiivistelmä (fin): | Tämän työn tavoitteena oli kehittää uudenlaisia mikrofluidistisia sovelluksia proteomiikkaan hyödyntäen kapillaarielektroforeesi-sähkösumutusionisaatio-massaspektrometriaa (CE-ESI/MS). Työssä käytetyt mikrosirut valmistettiin SU-8-polymeerista aiemmin kehitettyjen mikrovalmistusmenetelmien mukaisesti. Työssä käytettiin kolmea eri mikrosirumallia, jotka tyypillisesti koostuivat ESI-kärkeen monoliittisesti liitetyistä näytteensyöttö- ja CE-erotusyksiköistä. Mikrosirujen soveltuvuutta nopeaan proteiinianalytiikkaan tutkittiin käyttäen malliaineena humaani erytropoietiinia (EPO). Sekä rekombinantti humaani erytropoietiinin (rHuEPO) että endogeenisen EPO:n aminohappojärjestys määritettiin entsymaattisesti hajotettujen aminohapposekvenssien avulla. Molemmat EPO-analogit pystyttiin luotettavasti tunnistamaan kapillaarivyöhyke-elektroforeesin (CZE) ja ESIJMS-detektion perusteella. Todennäköisyysvastaavuuteen perustuvalla Mascot-haulla rHuEPO:n luotettavuusasteeksi saatiin 123 (luotettavuusraja >56) ja sekvenssikattavuudeksi 36 %. Vastaavat luvut endogeeniselle EPO:lle olivat 98 ja 48 %. Aminohapposekvenssien lisäksi mikrosiruanalyysi mahdollisti muutamien potentiaalisten glykopeptidien tunnistamisen GlycoMod-tietokannan avulla. Mikrosiru-CE-ESI/MS-tekniikoita, kapillaarivyöhyke-elektroforeesia (CZE) ja kapillaari-isoelektristä fokusointia (cIEF), testattiin myös glykoproteiinien analyysiin, mutta näiden luotettava tunnistus ei ollut mahdollista tämän työn puitteissa. CE-ESI/MS-tekniikoiden ohella työssä kehitettiin kaksi vaihtoehtoista mikrosirutekniikkaa proteiinianalytiikan helpottamiseksi. Mikrosirulla tapahtuva, happokatalysoitu reaktio yhdistettynä suoraan ESI/MS-detektioon mahdollisti nopean aminohappoketjun pilkkoutumisen asparagiinihapon kohdalla. Korkea lämpötila (+100°C) ja asparagiinihapon esteetön sijainti olivat kuitenkin edellytyksiä nopealle pilkkoutumiselle. Suurempien proteiinien pilkkominen edellyttänee erityisesti mikrosirun lämmitysprosessin tehostamista. Mikrosirulla tapahtuva aminohappojen derivatisointi toteutettiin tuomalla derivatisointireagenssi, 9-fluorenyylimetyylikloroformaatti (Fmoc-Cl), apuliuoksen mukana ESI-kärkeen, mikä mahdollisti nopean reaktion Fmoc-Cl:n ja erotuskanavassa erotettujen aminohappojen välillä. Nopein reaktiokinetiikka havaittiin aminohapoilla, joiden sivuketjun koko oli pienin. |
| Tiivistelmä (eng): | The aim of this work was to develop new microfluidic tools for proteomics research by exploiting capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry (CE-ESI/MS). The microchips used were made of SU-8 polymer according to a previously developed microfabrication protocol. Three different microchip designs were utilized. A typical design comprised a CE sample injection and separation unit in addition to monolithically integrated ESI emitter with on-chip sheath liquid interface. The applicability of the microchips to rapid protein characterization was demonstrated with human erythropoietin as a model compound. Protein sequencing of both recombinant human erythropoietin (rHuEPO) and endogenous EPO was demonstrated using microchip capillary zone electrophoretic (CZE) separation and ESI/MS detection of enzymatically (off-chip) cleaved peptides. As a result, a number of characteristic peptide sequences were detected enabling confident identification of both rHuEPO (score 123) and endogenous EPO (score 98) by Mascot probability based search engine with confidence limit score of>56. The detected peptides covered 36 % and 48 % of the amino acid sequences of rHuEPO and endogenous EPO, respectively. In addition, few potential glycopeptide assignments were identified with the help of GlycoMod online database. Intact EPO glycoforms were also analyzed by microchip CZE-ESI/MS and capillary isoelectric focusing (cIEF)-ESI/MS, but no confident identification of the intact glycoforms was obtained due to insufficient separation, detection sensitivity and/or data interpretation. With a view to improved protein characterization, two alternative microchip techniques were examined, namely, on-chip proteolytic digestion and specific on-chip derivatization of the amino acid residues prior to online ESI/MS detection. Tentative results of the on-chip proteolytic digestion showed that acid-induced degradation at aspartic acid provides rapid proteolytic degradation provided that the microchip can be heated up to +100°C and the cleavage site is easily accessible. However, further development of the microchip heating process seems as a prerequisite for rapid degradation of more complex proteins. On-chip derivatization of the separated amino acids was implemented by applying the derivatization reagent, 9-fluorenylmethyl chloroformate (Fmoc-Cl), to the ESI emitter along with the sheath liquid. Rapid reaction between Fmoc-Cl and selected amino acids was demonstrated. The reaction seemed to occur fastest toward the amino acids with the smallest side chain structure. |
| ED: | 2010-07-05 |
INSSI tietueen numero: 39810
+ lisää koriin
« edellinen | seuraava »
INSSI