search query: @keyword intein / total: 2
results-list
reference: 2 / 2
« previous | next »
Author:Jaakkonen, Anniina
Title:Production of antibody Fc fusion proteins by intein-mediated splicing
Fc-fuusioproteiinien tuotto inteiini-välitteistä silmukointia hyödyntäen
Publication type:Master's thesis
Publication year:2012
Pages:ix + 81 + [21]      Language:   eng
Department/School:Biotekniikan ja kemian tekniikan laitos
Main subject:Bioprosessitekniikka   (Kem-70)
Supervisor:Leisola, Matti
Instructor:Iwai, Hideo
OEVS:
Electronic archive copy is available via Aalto Thesis Database.
Instructions
close

Reading digital theses in the closed network of the Aalto University Harald Herlin Learning Centre

In the closed network of Learning Centre you can read digital and digitized theses not available in the open network.

The Learning Centre contact details and opening hours: https://learningcentre.aalto.fi/en/harald-herlin-learning-centre/

You can read theses on the Learning Centre customer computers, which are available on all floors.

Logging on to the customer computers

  • Aalto University staff members log on to the customer computer using the Aalto username and password.
  • Other customers log on using a shared username and password.

Opening a thesis

  • On the desktop of the customer computers, you will find an icon titled:

    Aalto Thesis Database

  • Click on the icon to search for and open the thesis you are looking for from Aaltodoc database. You can find the thesis file by clicking the link on the OEV or OEVS field.

Reading the thesis

  • You can either print the thesis or read it on the customer computer screen.
  • You cannot save the thesis file on a flash drive or email it.
  • You cannot copy text or images from the file.
  • You cannot edit the file.

Printing the thesis

  • You can print the thesis for your personal study or research use.
  • Aalto University students and staff members may print black-and-white prints on the PrintingPoint devices when using the computer with personal Aalto username and password. Color printing is possible using the printer u90203-psc3, which is located near the customer service. Color printing is subject to a charge to Aalto University students and staff members.
  • Other customers can use the printer u90203-psc3. All printing is subject to a charge to non-University members.
Location:P1 Ark Aalto  1973   | Archive
Keywords:antibody
Fc
protein trans-splicing
intein
brevibacillus choshinensis
scytovirin
vasta-aine
proteiinien trans-silmukointi
inteiini
sytoviriini
Abstract (eng): Antibodies have become well-established therapeutic proteins and represent the fastest growing sector in the pharmaceutical industry.
Novel antibody therapeutics has been generated, for example, by fusing antibody fragments to heterologous functional protein moieties.
Traditionally, these fusion proteins have been produced by gene fusion methods.
These methods, however, can be challenged by complexity of the molecule, often necessitating cloning and expression in a mammalian host.
The use of mammalian hosts is expensive, time-consuming and technically challenging, and production needs to be optimized for every new protein.

To address these difficulties, this thesis aimed, firstly, to develop a method for fusing antibody Fc (Fragment crystallisable) to diverse amino-terminal peptide moieties in vitro by protein trans-splicing.
Protein trans-splicing is a posttranslational reaction in which two split intein halves associate and catalyse ligation of the flanking peptide sequences.
This intein-mediated method could allow microbial protein expression, thus enabling the generation of antibody fusion proteins with lesser technological resources, time, and costs.
Secondly, this thesis aimed to adopt Brevibacillus choshinensis as a shake flask-scale bacterial host for the expression of biologically relevant intein-Fc chimeras, and thirdly, apply the aforementioned methods to produce an antibody fusion protein targeted against human immunodeficiency virus (HIV).
For HIV binding, the Fc of human immunoglobulin G1 was to be trans-spliced to a lectin protein scytovirin (SVN).

This thesis project showed that the trans-splicing method was applicable in generating antibody fusion proteins.
The tested intein-Fc constructs trans-spliced efficiently with heterologous aminoterminal moieties.
Although the reaction required mild reducing conditions, gel electrophoresis and affinity to staphylococcal protein A suggested the disulphide-bonded antibody structure to have been preserved.
B. choshinensis expressed the intein-Fc chimeras in a biologically active conformation, without undesirable posttranslational modifications, as confirmed by protein A affinity and mass spectrometry, respectively.
However, the protein yields were low (1.3 mg/L of purified protein in a shake flask) and highly influenced by culturing conditions, requiring further optimization.
The SVN-intein construct showed efficiency in trans-splicing although lacked the native, biologically active fold of SVN, as revealed by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy.
Abstract (fin): Vasta-aineita käytetään terapeuttisina proteiineina monien sairauksien hoidossa.
Ne ovat nopeimmin kasvava sovellusalue lääketeollisuudessa.
Vasta-ainemolekyyleja on muokattu uudenlaisiin terapeuttisiin sovelluksiin molekyylibiologisin menetelmin, esimerkiksi fuusioimalla vasta-aineiden osia muihin toiminnallisiin proteiiniosiin.
Perinteisesti näitä fuusioproteiineja on tuotettu kimeeristen geenien avulla, mikä voi kuitenkin olla haastavaa molekyylin kompleksisuudesta johtuen.
Molekyylin kompleksisuus edellyttää usein proteiinin tuottoa eläinsoluissa, mikä puolestaan on kallista, aikaa vievi3a ja teknisesti haastavaa.
Lisaksi tuotto joudutaan optimoimaan jokaiselle uudelle proteiinille.

Näiden haasteiden helpottamiseksi tässä työssä kehitettiin ensisijaisesti menetelmää vasta-aineen Fc (Fragment crystallizable) -osan liittämiseksi erilaisiin aminoterminaalisiin proteiiniosiin hyödyntäen proteiinien trans-silmukointia in vitro.
Proteiinien trans-silmukointi on reaktio, jossa kaksi inteiinin puoliskoa yhdistyy ja katalysoi niihin liittyneiden peptidikeljujen yhdistämisen peptidisidoksella.
Tämä inteiini-välitteinen menetelmä voisi mahdollistaa proteiinin tuoton mikrobi-isännässä, jolloin Fc-fuusioproteiini saataisiin tuotettua sovellustestaukseen nykyistä helpommin.
Työn toisena ja kolmantena tavoitteena oli tuottaa inteiini-Fc-proteiineja Brevibacillus choshinensis -bakteerissa ravistelupulloissa ja käyttää edellä mainittuja menetelmiä ihmisen immuunikatovirusta (engl. human immunodeficiency virus, HIV) tunnistavan Fc-fuusioproteiinin tuottamiseen.
HI-viruksen tunnistamiseksi Fc liitettiin sytoviriini-proteiiniin (engl. scytovirin, SVN) trans-silmukoinnin avulla.

Tämä työ osoitti, että trans-silmukointi soveltuu Fc-fuusioproteiinien tuottamiseen.
Työssä testatut inteiini-Fc-konstruktit silmukoituivat onnistuneesti erilaisten aminoterminaalisten proteiiniosien kanssa.
Vaikka reaktio edellytti pelkistäviä olosuhteita, geelielektroforeesi ja sitoutuminen stafylokokkibakteerin proteiini A:han osoittivat vasta-aineen biologiselle aktiivisuudelle tärkeiden rikkisiltojen säilyneen.
B. choshinensis tuotti inteiini-Fc-prekursorit kasvatusliuokseen biologisesti aktiivisessa muodossa, minkä osoitti sitoutuminen proteiini A:han.
Ei-toivottujen translaation jälkeisten muokkausten puuttuminen varmennettiin massaspektrometrian avulla.
Proteiinin saannot jäivät . kuitenkin alhaisiksi (1,3 mg/L puhdistettua proteiinia ravistelupullossa), ja kasvatusolosuhteiden huomattiin vaikuttavan merkittävästi proteiinin tuottoon, minkä vuoksi olosuhteiden lisäoptimointia suositellaan saannon parantamiseksi.
SVN-inteiini-prekursori silmukoitui onnistuneesti, mutta SVN:n aktiivista rakennetta ei havaittu NMR-spektrissä.
ED:2012-05-21
INSSI record number: 44596
+ add basket
« previous | next »
INSSI